摘 要： 目的 探討刺五加腦靈膠囊對氯化鋁致癡呆小鼠的保護作用。方法將60只SPF級昆明種小鼠隨機分為正常對照組、模型組、刺五加腦靈膠囊高、中、低劑量 (1.01、0.33、0.10 g/kg) 組。采用腹腔注射三氯化鋁建立阿爾茨海默病 (AD) 小鼠模型。觀察刺五加腦靈膠囊對AD小鼠學習記憶能力、乙酰膽堿酯酶 (AchE) 、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶 (ChAT) 和β-淀粉樣蛋白 (Aβ) 的影響。結(jié)果 刺五加腦靈膠囊高劑量組自主活動次數(shù)顯著多于模型組;刺五加腦靈膠囊組上岸時間顯著縮短, 錯誤次數(shù)顯著減少;刺五加腦靈膠囊中、高劑量組小鼠腦組織Aβ含量顯著降低, AchE活性顯著降低, ChAT活性顯著增加 (均P<0.05) 。結(jié)論 刺五加腦靈膠囊能減少Aβ沉積, 增強ChAT活性同時降低AchE活性, 對氯化鋁致癡呆小鼠有一定的改善和保護作用。

阿爾茨海默病 (AD) 主要臨床特征是患者出現(xiàn)智力、記憶力、感覺定向的不可逆退化[1]。2010年世界AD患者大約有3 560萬, 預計到2050年, 世界AD患者的數(shù)量將達到1億1千萬, 其中中國AD患者將接近2 000萬[2,3]。中醫(yī)在養(yǎng)生保健、益智健腦方面有著豐富的理論、實踐經(jīng)驗, 為篩選中藥有效成分防治癡呆提供了基礎(chǔ)[4]。中藥刺五加為五加科植物, 味辛、微苦、性溫、無毒, 具有多種藥理作用和臨床應(yīng)用, 能益氣健脾、補腎安神[5]。而五味子中的主要成分對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有改善學習、記憶, 鎮(zhèn)靜, 催眠, 抗衰老的作用[6]。刺五加腦靈膠囊由刺五加浸膏和五味子流浸膏組成, 用于心脾兩虛、腎不足所致的健忘、心神不寧、失眠多夢等。本研究觀察刺五加腦靈膠囊對AD模型小鼠學習記憶、乙酰膽堿酯酶 (Ach E) 、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶 (Ch AT) 和β-淀粉樣蛋白 (Aβ) 的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級昆明種小鼠, 60只, 雌雄各半, 17~19 g (中國藥品生物制品檢定所實驗動物繁育場提供) 。XZ-4小鼠自主活動自動控制記錄儀、LW-I小鼠水迷宮測試儀 (中國醫(yī)學科學院藥物研究所) ;臺式低速離心機 (湖南凱達科學儀器有限公司) ;酶標儀 (美國Thermo公司) 。刺五加腦靈膠囊 (山東仙河藥業(yè)有限公司) ;三氯化鋁 (北京市李遂化工廠) ;Aβ、Ch AT、Ach E檢測試劑盒 (南京建成生物工程研究所) 。

1.2 分組及給藥

將60只小鼠隨機分為正常對照組、模型組、刺五加腦靈膠囊高、中、低劑量 (1.01、0.33、0.10 g/kg) 組。刺五加腦靈膠囊組灌胃給予相應(yīng)藥物, 模型組和正常對照組灌胃給予同體積生理鹽水, 連續(xù)58 d。

1.3 建立AD小鼠模型

所有造模動物從給藥后第5天開始隔日1次腹腔注射三氯化鋁100 mg/kg (0.1 ml/10 g) 造模, 正常對照組腹腔注射同體積生理鹽水, 連續(xù)50 d。

1.4 行為學測試

造模第51天, 小鼠灌胃給藥后1 h, 放入XZ-4小鼠自主活動計數(shù)儀中, 穩(wěn)定5 min后, 記錄小鼠5 min內(nèi)活動數(shù)。造模第53天, 于暗室中將LW-I水迷宮自動控制記錄儀通電, 放水, 水溫20℃~21℃, 室溫20℃。小鼠灌胃給藥后1 h, 放入水迷宮中訓練A點1次, 最長上岸時間以2 min為止。2 h后再訓練A點1次, 記錄上岸時間和回頭錯誤次數(shù);再4 h后放入B點, 記錄小鼠上岸時間和錯誤次數(shù), 上岸時間最長以2 min計。造模第54天, 將已訓練小鼠放入水迷宮B點, 測定上岸時間和回頭錯誤次數(shù), 上岸時間最長以2 min計。

1.5 指標檢測

58 d灌胃給藥結(jié)束后, 斷頭處死大鼠, 迅速取出腦組織, 置于冰盒上, 分離海馬并稱重。按照1∶10 (W∶V) 的比例加入冰生理鹽水勻漿, 3 000 r/min離心10 min, 取上清液待測。嚴格按照試劑盒說明書測定腦組織中Aβ含量、Ch AT、Ach E兩種酶的活性。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計學應(yīng)用軟件行單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 刺五加腦靈膠囊對AD小鼠自主活動的影響

表1可見, 模型組小鼠自主活動數(shù)量顯著少于正常對照組 (P<0.01) , 刺五加腦靈膠囊高劑量組自主活動次數(shù)顯著多于模型組 (P<0.05) 。各組小鼠體重差異不明顯 (P>0.05) 。

表1 各組自主活動、體重比較 (n=12, ±s)

2.2 刺五加腦靈膠囊對AD小鼠學習記憶的影響

造模后, 模型組與正常對照組比較水迷宮試驗各點訓練和測試的上岸時間均延長, 錯誤次數(shù)均增多 (均P<0.01) 。刺五加腦靈膠囊高劑量組第2天測試的B點上岸時間顯著縮短, 低、中、高劑量組錯誤次數(shù)都顯著減少 (P<0.05, P<0.01) 。見表2。

2.3 刺五加腦靈膠囊對AD小鼠海馬組織Aβ、Ch AT、Ach E的影響

模型組小鼠海馬組織Aβ含量顯著高于正常對照組 (均P<0.01) , Ch AT活性顯著低于正常對照組, Ach E活性顯著高于正常對照組。與模型組比較, 刺五加腦靈膠囊中、高劑量組小鼠海馬組織Aβ含量顯著降低, Ch AT活性顯著增加, Ach E活性顯著降低 (P<0.05, P<0.01) 。見表2。

表2 各組學習記憶、海馬組織Aβ、Ch AT、Ach E的影響 (n=12, ±s)

3 討論

鋁可導致腦組織神經(jīng)元纖維纏結(jié)和老年斑的形成[7]。調(diào)查研究發(fā)現(xiàn), 飲用水含鋁量高的地區(qū), AD的發(fā)病率較高, 為其他地區(qū)的1.5~2.7倍[8]。同時, 動物實驗表明, 鋁在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的沉積可明顯抑制學習記憶功能, 使動物出現(xiàn)AD的特征性病理改變[9]。本研究顯示刺五加腦靈膠囊有較好的改善AD小鼠學習記憶能力的作用。AD是多病因相互作用的結(jié)果, 其中, 老年斑主要是由具有神經(jīng)毒性和血管毒性的Aβ生成, 同時, Aβ沉積又可導致突觸和神經(jīng)棘缺失, 嚴重影響神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)功能, 最終造成大腦學習記憶和認知能力損傷[10]。在正常生理狀態(tài)下, 大腦僅表達少量的Aβ, 低濃度的Aβ可營養(yǎng)未分化、不成熟的神經(jīng)元;而在AD大腦中Aβ則大量表達, 高濃度的Aβ能損傷已分化、成熟的神經(jīng)元[11]。Aβ沉積可激活星形膠質(zhì)細胞、小膠質(zhì)細胞, 促進其釋放促炎因子和一氧化氮, 從而引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)[12];聚集的Aβ可引起神經(jīng)元反應(yīng)性活性氧增高, 造成神經(jīng)元氧化損傷;可破壞神經(jīng)細胞內(nèi)的鈣離子穩(wěn)態(tài)平衡[13];還可改變線粒體形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理功能, 進而誘導神經(jīng)元凋亡[14]。Ach E的作用是分解乙酰膽堿, 與Ch AT共同調(diào)節(jié)乙酰膽堿的動態(tài)平衡[15]。同時, Ach E作為乙酰膽堿的水解酶, 其變化一般晚于Ch AT, 因此在AD發(fā)病初期, 由于Ch AT異常所致合成減少的乙酰膽堿, 仍被正常的Ach E分解, 致使突觸間乙酰膽堿含量的減少[16]。Aβ沉積會增加Ach E表達, 在AD患者大腦老年斑和膽堿能神經(jīng)元丟失區(qū)域內(nèi)Ach E活性顯著升高, 造成乙酰膽堿異常。Ach E又能促進Aβ生成, 加速其聚積[17], 進而形成一種惡性循環(huán)。

綜上所述, 在AD的發(fā)病機制中膽堿能神經(jīng)異常及Aβ毒性在其發(fā)病中占有重要作用。到目前為止, 美國FDA認可上市的治療AD的藥物主要是Ach E抑制劑, 即通過降低Ach E的活性提高大腦中Ach E的含量, 進而改善神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)的學習和記憶功能的下降[18]。因此, 探尋毒副作用小而功效作用強的Ach E抑制劑, 是研究防治AD藥物的有效途徑之一。本研究提示刺五加腦靈膠囊能夠通過減少Aβ沉積, 增加Ch AT活性, 降低Ach E活性, 改善小鼠海馬膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能, 達到防治AD的作用。但是, 由于刺五加腦靈膠囊成分復雜, 其確切地改善學習記憶能力的物質(zhì)基礎(chǔ)尚不清楚, 且其調(diào)節(jié)AD的具體分子機制也有待進一步闡明。

參考文獻

[1] Houmani N, Vialatte FB, Latchoumane C, et al.Stationary epoch-based entropy estimation for early diagnosis of Alzheimer’s disease[J].ICIP, 2013;302:1241-4.

[2] Prince M, Bryce R, Albanese E, et al.The global prevalence of dementia:a systematic review and metaanalysis[J].Alzheimers Dement, 2013;9 (1) :63-75.

[3]王晶.我國阿爾茨海默病的流行現(xiàn)狀及預防措施[J].亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥, 2011;7 (2) :157-8.

[4]陳新梅.抗老年癡呆藥物研究進展[J].中國民族民間醫(yī)藥, 2011;20 (3) :30.

[5]張茹, 李廷利, 劉曉巖.刺五加對睡眠剝奪大鼠學習記憶及海馬LTP的影響[J].中藥藥理與臨床, 2011;27 (1) :63-6.

[6]謝云亮.五味子有效成分分離純化及對記憶障礙模型小鼠學習記憶的影響[D].長春:吉林大學, 2013.

[7]尹學均.鋁與Alzheimer病[J].國外醫(yī)學衛(wèi)生分冊, 1995;22 (4) :193-7.

[8]呂永貞, 張麗.老年癡呆的臨床分析與護理[J].工企醫(yī)刊, 2006;19 (2) :551.

[9]張忠賢, 孫秀發(fā), 朱清華.鋁與脂質(zhì)過氧化[J].國外醫(yī)學 (衛(wèi)生學分冊) , 1999;26 (4) :219-41.

[10]鄭博聞, 黃漢昌, 路書彥, 等.阿爾茨海默病理條件下突觸系統(tǒng)病變的研究進展[J].生命科學, 2015;2:182-90.

[11] Atwood CS, Obrenovich ME, Liu T, et al.Amyloid-β:a chameleon walking in two worlds:a review of the trophic and toxic properties of amyloid-β[J].Brain Res Rev, 2003;43 (3) :1-16.

[12] Saha RN, Pahan K.Regulation of inducible nitric oxide synthase gene in glial cells[J].Antioxid Redox Signal, 2006;8 (5-6) :929-47.

[13]黃漢昌, 姜瑞瑞, 林婧, 等.阿爾茨海默病發(fā)生機制及其治療藥物研究進展[J].中國老年學雜志, 2011;31 (15) :2993-7.

[14]武福軍, 詹永樂, 朱飛奇.線粒體變化機制與阿爾茨海默病[J].中國老年學雜志, 2011;31 (2) :354-7.

[15]毛曉霞, 苗光新, 吳曉光, 等.山楂葉總黃酮對血管性癡呆大鼠學習記憶及海馬ACh E, Ch AT活性的影響[J].中國實驗方劑學雜志, 2014;17:167-70.

[16]蒲亞嵐, 王永紅.阿爾茨海默病中樞膽堿能系統(tǒng)的損傷及主要機制[J].中國老年學雜志, 2010;30 (24) :3840-2.

[17] Jean L, Thomas B, Tahiri-Alaoui A, et al.Heterologous amyloid seeding:revisiting the role of acetylcholinesterase in Alzheimer's disease[J].PLo S One, 2007;2 (7) :e652.

[18] Huang Y, Mucke L.Alzheimer mechanisms and therapeutic strategies[J].Cell, 2012;148 (6) :1204-22.

作者簡介：孫雅煊 (1970-) , 女, 博士, 教授, 碩士生導師, 主要從事生物活性物質(zhì)的提取及生理功能研究。

作者簡介：賈世亮 (1990-) , 男, 碩士, 主要從事生物活性物質(zhì)的生理功能研究。