摘 要： 目的 探討D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁 (AlCl₃) 對C57小鼠海馬B淋巴細(xì)胞瘤-2 (Bcl₂) 表達(dá)的影響及在阿爾茨海默病 (AD) 發(fā)病中的意義。方法 D-半乳糖90 mg·kg-1·d-1聯(lián)合AlCl3 40 mg·kg-1·d-1連續(xù)90 d腹腔注射制造AD小鼠模型;通過比較全腦圖片及糖水實驗初步鑒定模型復(fù)制是否成功;免疫組化檢測AD及野生型對照組小鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)Bcl2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 與對照組比較, AD小鼠完整腦組織表面泛白、無血色, 血管明顯減少。糖水偏好實驗:與對照組比較, AD組小鼠糖水偏好百分比明顯下降 (P<0.01) 。與對照組相比, AD小鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)Bcl2蛋白陽性表達(dá)明顯減少, 呈深棕色陽性顆粒數(shù)目明顯減少 (CA1、CA3區(qū)P<0.05;DG區(qū)P<0.01) 。結(jié)論 D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁通過抑制Bcl2的表達(dá), 導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞異常凋亡, 進(jìn)而引起AD的發(fā)生、發(fā)展。 阿爾茨海默病 (AD) 又稱老年性癡呆, 是發(fā)生于老年和老年前期、以進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變, 是一種慢性進(jìn)行性中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病?；浊澳X膽堿能神經(jīng)元丟失、神經(jīng)原纖維纏結(jié) (NFT) 和老年斑 (SP) 等為AD的主要病理特征。細(xì)胞凋亡信號通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長發(fā)育、衰老退化進(jìn)程中都起著關(guān)鍵作用。在發(fā)育過程中, 為對抗一因多效, 細(xì)胞凋亡會損傷一些衰老的細(xì)胞, 利用這種程序性的方式, 可以將這些衰老的神經(jīng)細(xì)胞移除。在成年腦組織中, 神經(jīng)元通過抗細(xì)胞凋亡保持神經(jīng)突觸的可塑性并維持生存。B淋巴細(xì)胞瘤-2 (Bcl₂) 屬于抗細(xì)胞凋亡家族成員, 可以調(diào)節(jié)某些前細(xì)胞凋亡因子, 如Bax的表達(dá)。此外, 增加Bcl2的表達(dá)可以降低Bax表達(dá), 抑制凋亡復(fù)合體的形成, 達(dá)到抗細(xì)胞凋亡的目的。本研究擬觀察D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁對C57小鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)Bcl2表達(dá)的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

清潔級雄性C57小鼠, 購于湖北省實驗動物研究中心, 動物許可證號:SCXK (鄂) 2008-0005。

1.2 方法

1.2.1 建立AD小鼠模型

選用清潔級健康雄性C57小鼠, 體重15~20 g, 安靜環(huán)境飼養(yǎng), 自由取食飲水, 通風(fēng)良好, 室溫22℃~25℃, 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后隨機(jī)分為兩組, 每組15只。AD組采用Luo等的造模方法腹腔注射D-半乳糖 (武漢科瑞生物) 90 mg·kg·d (生理鹽水配制) 和Al Cl3 (天津福晨化學(xué)試劑廠) 40 mg·kg·d (生理鹽水配制) 溶液, 連續(xù)90 d;野生型對照組腹腔注射等量的生理鹽水。

1.2.2 糖水偏好實驗

用糖水和自來水雙瓶給實驗大鼠供飲, 通過測量剝奪飲水12h后大鼠1 h內(nèi)的糖水和自來水消耗量, 計算糖水偏好百分比 (糖水偏好百分比=糖水消耗量/總液體消耗×100%) 。

1.2.3 免疫組織化學(xué)

1.2.3. 1 相關(guān)步驟

行為學(xué)實驗結(jié)束后, 小鼠用10%苯巴比妥 (300 mg/kg) 腹腔注射麻醉, 打開胸腔, 暴露心臟。將注射針頭插入左心室, 剪開右心耳, 快速灌注生理鹽水, 待右心耳處流出澄清液體, 換4%多聚甲醛10ml/min灌注至大鼠四肢強(qiáng)直, 然后將小鼠斷頭, 快速取出腦組織, 置4%多聚甲醛中固定、過夜。常規(guī)石蠟包埋腦組織, 約5μl矢狀切片。切片常規(guī)脫蠟, 將切片浸入檸檬酸鹽緩沖液微波爐加熱至沸騰, 3 min×5次。冷卻后磷酸鹽緩沖液 (PBS, p H 7.2~7.6) 洗滌3次。滴加3%H2O2室溫孵育15 min (消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性) , PBS洗3 min×3次。正常山羊血清封閉, 室溫孵育10 min。傾去血清, 不洗, 滴加一抗鼠抗Bcl2抗體 (1∶200, A0208, Abclonal公司, 美國) , 4℃過夜, PBS洗3 min×3次, 滴加生物素標(biāo)記的二抗, 37℃孵育20 min, PBS洗3 min×3次。二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) (GK600710, 上?；蚩萍脊? 顯色, 顯微鏡下控制顯色。蘇木精復(fù)染, 梯度酒精脫水, 二甲苯透明, 中性樹膠封片后鏡下觀察蛋白表達(dá), 拍照, 留存。

1.2.3. 2 結(jié)果判讀及圖像分析

顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和DG區(qū)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色的物質(zhì)為Bcl2陽性染色。采用Image-Pro Plus6.0圖像分析系統(tǒng), 對每例Bcl2免疫組化染色切片的陽性表達(dá)顆粒進(jìn)行定量測量。每張切片放大10×40倍, 隨機(jī)選取5個視野, 測量Bcl-2陽性表達(dá)細(xì)胞的平均光密度 (OD值) 。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計軟件, 計量資料組間比較行t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 AD和對照組全腦圖

與對照組比較, AD小鼠完整腦組織表面泛白、無血色, 血管明顯減少, 表明D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁已經(jīng)對小鼠的腦組織形成退行性損傷。見圖1。

圖1 AD組和對照組小鼠全腦圖

2.2 體重比較和糖水偏好實驗結(jié)果

與對照組〔 (24.87±2.21) g〕比較, AD組小鼠的體重〔 (20.98±1.65) g〕明顯下降 (P<0.05) ;與對照組〔 (94.38±8.39) η/%〕比較, AD組小鼠糖水偏好百分比〔 (56.67±4.46) η/%〕明顯下降 (P<0.01) 。

2.3 免疫組化結(jié)果

與對照組相比, AD小鼠海馬CA1、CA3和DG區(qū)Bcl2蛋白陽性表達(dá)明顯減少, 呈深棕色陽性顆粒數(shù)目明顯減少 (P<0.05, P<0.01) 。見圖2, 表1。

圖2 兩組小鼠各區(qū)Bcl2表達(dá)免疫組化結(jié)果 (×400)

表1 兩組小鼠海馬各區(qū)Bcl2蛋白的表達(dá)比較 (n=15, ±s)

3 討論

Luo等的實驗結(jié)果表明, 利用D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁制備AD小鼠模型, AD組小鼠表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶減退、皮質(zhì)和海馬區(qū)β淀粉樣蛋白 (Aβ) 水平增高、Aβ代謝相關(guān)分子表達(dá)受影響, 可形成NFT、SP等典型的AD癥狀, 表明D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁誘導(dǎo)AD小鼠是一種穩(wěn)定的、為國內(nèi)外科研工作者所接受的AD動物模型。最新研究表明, D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁可造成小鼠海馬區(qū)超氧化物歧化酶 (SOD) 等的活性下降, 導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶能力降低等AD癥狀的產(chǎn)生。神經(jīng)細(xì)胞凋亡增加與神經(jīng)退行性病變, 如AD等高度正相關(guān), 細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶退行性病變的機(jī)制之一。海馬在認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶形成過程中起著重要作用。Bcl2在細(xì)胞線粒體外膜表面, 通過抑制線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子 (AIF) , 抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca等;同時, 通過調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)外膜的通透性抗細(xì)胞凋亡;此外, Bcl2還可抑制細(xì)胞超氧化合物的積累;Bax/Bax同源二聚體可以被Bcl2/Bax異源二聚體競爭性抑制, 從而達(dá)到抗細(xì)胞凋亡的目的。Bcl2可能通過維持細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài), 抑制促凋亡蛋白的釋放, 抑制凋亡蛋白酶的活化及直接抗氧化等抗細(xì)胞凋亡。

免疫組化檢測結(jié)果提示, D-半乳糖聯(lián)合三氯化鋁通過抑制抗細(xì)胞凋亡因子Bcl2的表達(dá), 激活程序性的細(xì)胞凋亡信號通路, 導(dǎo)致海馬神經(jīng)細(xì)胞異常凋亡, 進(jìn)而引起AD的發(fā)生、發(fā)展。

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作者簡介：劉洋 (1979-) , 男, 博士, 講師, 主要從事神經(jīng)退行性疾病分子機(jī)制研究。

作者簡介：陳瑤 (1982-) , 女, 碩士, 主治醫(yī)師, 主要從事神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機(jī)制研究。